瑞普动态
江南大学生物工程学院院长刘龙教授在营养健康食品产业创新发展高峰论坛上发布了“构建细胞工厂高效合成婴配奶粉关键功能营养因子”的主题报告。
刘龙教授对婴幼儿配方奶粉的定义及其关键功能营养因子简单介绍后，重点阐述了通过构建细胞工厂高效合成婴配奶粉关键功能营养因子的最新研究进展。01背景介绍
婴幼儿配方奶粉是以牛乳/大豆等为主要原料，加入适量的脂质、寡糖和其他辅料，调节成分模拟母乳加工而成的婴幼儿配方食品。
母乳中的主要营养成分有蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质以及其他各种生物活性物质，其中蛋白质中的乳铁蛋白（LF），脂质中的甘油三酯（TAG）以及碳水化合物中的母乳寡糖可通过细胞工厂进行高效生产。
微生物细胞工厂是指利用微生物强大的生物转化或合成能力，基于合成生物学等技术开发构筑的能够进行物质生产的人工代谢体系。02研究成果01乳铁蛋白细胞工程的构建
乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是一种非血红素铁结合糖蛋白，在体内行使转运铁离子的作用；LF也是母乳中的核心免疫蛋白，是婴幼儿成长发育中不可或缺的重要营养。
将乳铁蛋白(LF)编码基因转入毕赤酵母中，并通过表达分子伴侣与促溶标签辅助蛋白折叠，LF摇瓶中产量达到537 μg/L，通过研究发现，乳铁蛋白积聚在内质网和高尔基中，说明蛋白分泌是主要限制因素。
通过信号肽筛选、杂合信号肽构建、核糖体蛋白强化、转录因子过表达等的优化后，LF摇瓶中产量达到654.5 mg/L。
在3-L发酵罐中对甲醇诱导条件进行优化调控，LF产量达到5.38 g/L；并且对纯化后的LF进行生理活性检测，当LF浓度达到10 mg/L时抑菌率为35%，且未对动物细胞形态产生影响。02母乳脂质细胞工厂的构建
母乳脂质(98%-99%为甘油三酯，TAG)是母乳中的第二大固体成分，其中约70%的棕榈酸位于Sn-2位，不饱和脂肪酸位于Sn-1,3位(如OPO与OPL)。
在酿酒酵母中通过脂质合成强化、TAG合成途径重构及内质网形态调控等策略，TAG含量提升9.4倍且OPO占总TAG的比例由0%提升至1.9%。进一步通过脂肪酸合成酶系改造、酰基供体比例优化及关键基因表达强化等策略，OPO占总TAG的比例由1.9%提升至12.9%(产量为1.9 mg/g DCW)。
03母乳寡糖（HMOs）细胞工厂的构建
母乳寡糖(HMOs)是母乳中仅次于乳糖和脂质的第三大固体成分，主要分为岩藻糖基化HMOs、乙酰基化HMOs和唾液酸化HMOs三类，具有支持免疫系统、消化健康及大脑发育等功能。
刘龙教授团队利用底物转运系统优化、动态调控等合成生物学技术，能够创制可从头合成2＇-FL、LNnT、LNT、3′-SL、6′-SL和3-FL的系列HMOs细胞工厂。
其中对岩藻糖基化HMOs-2′-FL细胞工厂的构建研究时间较长，研究比较深入。
A、岩藻糖基化HMOs：2′-FL细胞工厂的构建
以大肠杆菌(E. coli)MG1655菌株为底盘细胞，通过合成途径优化重构、关键酶的稳定性表达以及辅因子供应体系优化，实现了以葡萄糖和乳糖为底物的2′-FL高效从头合成，3-L发酵罐中的产量与乳糖转化率分别为57.4 g/L与0.79 mol/mol
刘龙教授团队对2′-FL的细胞工厂构建研究中，一步一个脚印，逐步深入研究，最终达到的成果是3-L发酵罐中2′-FL的产量与乳糖转化率分别为88.3 g/L与0.61 g/g。
B、岩藻糖基化HMOs：3-FL细胞工厂的构建
在E. coli中，通过从头合成途径重构、糖基转移酶表达优化与分子改造、基于无膜细胞器的途径酶组装等策略，3-FL的摇瓶产量达到13.5 g/L。
C、岩藻糖基化HMOs：LNnT细胞工厂的构建
以B. subtilis 168为底盘细胞，通过异源途径的组装适配以及关键基因的表达优化，实现了以葡萄糖和乳糖为底物的LNnT从头合成，产量为1.31 g/L 基于dCas9创制了木糖诱导型的CRISPRi系统，对LNnT合成的竞争途径进行动态组合弱化，LNnT摇瓶产量提升至2.30 g/L，3-L发酵罐上产量达到5.4 g/L。
D、唾液酸化HMOs：3′-SL细胞工厂的构建
通过系统的表征、设计与优化，获得代谢途径精细调控工具-N端编码序列(NCS)，并利用该工具在B. subtilis中实现了3′-SL前体唾液酸的从头合成。经过一系列优化，最终3′-SL产量达到1252.1 mg/L。
刘龙教授团队利用合成生物学技术设计构筑了系列细胞工厂，从而实现了乳铁蛋白、母乳脂质、HMOs等婴配奶粉关键功能营养因子的高效合成、中试或工业化生产。
刘龙教授详细地介绍了他们团队在构建细胞工程高效合成婴配奶粉关键功能营养因子的研究工作，为进一步促进婴配奶粉行业的高质量发展具有重要意义。
